1. 简介
Bradford法是一种常用的快速测定蛋白质浓度的方法。它基于一种名为Coomassie Brillant Blue G-250的染料对蛋白质的选择性染色，实现蛋白质浓度与染料吸光度的相关性。该方法操作简单、快速，对样品类型和总蛋白质含量也没有明显的限制，被广泛应用于生物科学和制药领域。
2. Bradford法的基本原理
Bradford法基于染料吸附量与溶液中蛋白浓度成正比的原理。Coomassie Brilliant Blue G-250分子有负电荷，可以与蛋白质的碱性氨基酸残基（主要是赖氨酸、精氨酸和组氨酸）水解释放的带正电荷的氢离子相互作用，形成一种复合物。该复合物的吸光度与染料浓度和复合物的种类（蛋白质种类）相关，而与蛋白质的氨基酸序列无关。
3. Bradford法的实验步骤
实验前需要制备Bradford试剂，该试剂可商购或自制。通常将试剂制成浓度为100倍的工作液，将1mL的工作液与99mL的蒸馏水混合即可。实验中的其他试剂包括蛋白质样品、Boivin buffer（常用的标准溶液，用于制备不同浓度的蛋白质标准曲线）、96孔微孔板、移液管等。
以下为Bradford法测定蛋白质浓度的实验步骤：
1）将不同浓度的蛋白质标准溶液（通常为0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mg/mL）和待测蛋白质样品，分别加入96孔微孔板的每个孔中；
2）加入Bradford试剂（约100μL），轻轻振荡将试剂和蛋白质混合均匀，并静置反应30分钟；
3）读取吸光度（595nm），最好使用双波长法（570nm作为空白对照波长），记录各个孔的吸光度值；
4）计算标准曲线中各浓度下的平均吸光度及其标准差，绘制标准曲线；
5）用样品的吸光度值及标准曲线计算样品的蛋白质浓度。
4. Bradford法的注意事项
1）Bradford试剂对蛋白质样品的吸收波长较窄，即在595nm左右。因此读取吸光度时要注意准确读取与空白对照波长相差不大的波长；
2）Bradford试剂对某些化合物有干扰作用，会影响吸光度的测量。如酸、碱、还原剂、高浓度的氯离子和胆固醇等，需根据样品的特性及Bradford试剂的灵敏度进行考虑；
3）不同类型的蛋白质可能对Bradford试剂有不同程度的反应能力，导致不同类型的蛋白质在同一浓度下吸光度不一定相等。因此，建议在测定特定蛋白质浓度时，应以该蛋白质为标准制备标准曲线，以获得更准确的测定结果；
4）Bradford法测定蛋白质浓度的灵敏度通常在0.02-2.0 mg/mL范围内，对于浓度很低或很高的样品，需要进行适当的稀释或浓缩处理。
总之，Bradford法是一种简单、快速且广泛应用的蛋白质浓度测定方法。在实验操作的全过程中，需注意实验细节，特别是在样品种类、Bradford试剂饱和度和吸光度读取等方面，应仔细考虑相关因素。通过合理的实验设计和仔细的实验操作，Bradford法可以得到准确可靠的测定结果，为生物科学和制药研究提供重要的技术支持。
